血清血液禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法NY/T 680-2003国标检测，血清血液检测中心
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- 2026-03-19 07:00
NY/T 680-2003《禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法》国标检测的核心要点如下：
标准编号：NY/T 680-2003
发布日期：2003年7月30日
实施日期：2003年10月1日
适用范围：适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡胚组织细胞培养物中的禽白血病病毒（ALV）p27蛋白抗原。
技术基础：基于抗原抗体特异性结合的原理，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术。
反应过程：将特异性识别p27抗原的抗体固定于固相载体上，加入待检样品后，若样品中含有p27抗原，则抗原与固相上的抗体结合。洗涤去除未结合物质后，加入另一种标记有酶的抗体，这种抗体同样能特异性地与p27抗原结合。再次洗涤并添加底物溶液，通过酶催化底物产生颜色变化，Zui后借助于酶标仪测量每个孔内的吸光度值，从而间接反映出样品中p27抗原的含量。
抗p27蛋白抗体：应用提纯的禽成髓细胞性白血病病毒p27蛋白免疫家兔制备。
阳性抗原：含鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的鸡蛋清。
阴性抗原：无鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的SPF鸡蛋清。
酶结合物：辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体。
其他试剂：包括磷酸盐缓冲液（PBS）、包被液、洗涤液、样品稀释液、底物溶液、终止液等。
酶联检测仪：用于读取吸光值，需具备450nm波长检测功能。
聚苯乙烯板：用于包被抗体和进行ELISA反应。
微量加样器：容量50μL~200μL，用于准确量取各种试剂和样本。
恒温培养箱：用于样本和试剂的温育，需能控制温度。
样本采集与处理：
鸡蛋样品：将待检鸡蛋小的一端朝上放置，打碎蛋壳，用移液器无菌吸取蛋清，密装于灭菌小瓶内。
细胞培养物：用移液器无菌吸取细胞培养物，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃保存或立即送检。试验前将送检样品统一编号，试验时不做稀释。
包被板制备：
用包被液将抗p27蛋白抗体作4000倍稀释，每孔100μL加入96孔聚苯乙烯板中，4℃过夜。
加样与反应：
取出包被好的聚苯乙烯板，将液体倒弃，每孔加250μL洗涤液漂洗三次，每次2min，甩干。
每孔加150μL质量浓度为1%的明胶封闭液，37℃反应60min。
重复洗涤步骤。
在A1、A2孔各加100μL标准阴性对照，A3、A4孔各加100μL标准阳性对照。
将待检样品加入其他各孔，每个待检样本加两孔，每孔100μL，37℃反应60min。
重复洗涤步骤。
每孔加100μL工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体，37℃反应60min。
重复洗涤步骤。
每孔加100μL新配制的底物溶液，室温、避光反应10min。
每孔加100μL终止液。
结果读取与判定：
置酶联检测仪于450nm测定各孔吸光度（OD）值。
阴性对照OD均值=（ODA1+ODA2）/2；阳性对照OD均值=（ODA3+ODA4）/2。
阴性对照OD均值小于0.15，阳性对照OD均值减去阴性对照OD均值大于0.3时试验成立，否则重做。
计算样品孔OD均值与阴性对照OD均值的比值（SIP），当SIP小于等于0.2时判为阴性，表示待检样品中无ALVp27蛋白抗原；当SIP大于0.2时判为阳性，表示待检样品中有ALVp27蛋白抗原。