血清血液猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法GB/T34729-2017第三方检测机构
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- 2026-03-19 07:00
GB/T 34729-2017《猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法》标准检测的核心要点如下：
标准编号：GB/T 34729-2017
发布日期：2017年11月1日
实施日期：2018年5月1日
主管部门：农业农村部
归口单位：全国动物卫生标准化技术委员会
适用范围：适用于猪血清或血浆样本中猪瘟病毒（CSFV）抗体的定性分析，但无法区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体。
技术基础：基于抗原抗体特异性结合原理，采用阻断ELISA技术。
反应过程：将猪瘟病毒抗原包被在酶标板上，加入待检血清后，若血清中含有猪瘟病毒抗体，则抗体与包被抗原结合，阻断后续酶标单克隆抗体与抗原的结合。通过检测酶标单克隆抗体结合量，间接判断血清中猪瘟病毒抗体的存在与否及含量。
猪瘟病毒E2蛋白：需纯化处理，浓度一般为0.2μg/mL。
酶结合物：通常为HRP标记的单克隆抗体，需商品化或自行制备，并严格控制标记效率。
标准阳性血清：由猪瘟疫苗免疫仔猪制备，经荧光抗体病毒中和试验检测为阳性。
标准阴性血清：取自无母源抗体且未免疫猪瘟疫苗的仔猪，经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性。
其他试剂：包括包被液、磷酸盐缓冲液、封闭液、浓缩洗液、稀释液、底物液A、底物液B、终止液等。
酶标仪：用于读取吸光值，需具备450nm波长检测功能。
温箱：用于样本和试剂的温育，需能控制温度。
移液器：用于准确量取各种试剂和样本，需定期校准。
其他设备：如生物安全柜、离心机、微量振荡器等。
样本采集与处理：
采集猪静脉血，室温静置后离心分离血清。
血清样本应清亮、无溶血，若需长期保存应置于-20℃以下冷冻条件。
抗原包被：
用包被液将猪瘟病毒E2蛋白稀释至规定浓度，包被酶标板。
包被后的酶标板需置于2℃~8℃条件下过夜或按规定时间包被。
封闭处理：
包被结束后，弃去孔中液体，用封闭液封闭未结合的抗原位点。
样本检测：
在抗原包被板中加入稀释液和待检血清，同时设置阳性对照和阴性对照。
温育一定时间后，弃去反应液，用洗涤液洗涤板孔。
加入酶结合物，温育后再次洗涤。
加入底物液显色，避光反应一定时间后加入终止液终止反应。
结果读取与判定：
在酶标仪上读取各孔的吸光值。
计算阴性对照孔和阳性对照孔的平均值，以及样本的阻断率。
根据阻断率判定样本是否为阳性。
试验成立条件：标准阴性对照血清OD450nm值应≥0.5，标准阳性对照的阻断率应大于50%。
样本判定：
阻断率≤30%为样品抗体阴性。
阻断率在30%~40%之间为可疑。
阻断率≥40%为样品抗体阳性。
试剂储存与准备：试剂应按要求储存，使用前需平衡至室温。浓缩洗涤液使用前需按规定比例稀释。
样本处理：血清样本应避免反复冻融，采集过程需严格遵守无菌操作规程。
仪器校准与维护：酶标仪等仪器需定期校准和维护，确保检测结果的准确性。
生物安全：所有操作应遵守实验室生物安全规定，废弃物处理需符合相关法律法规要求。