血清血液伪狂犬病诊断方法GB/T18641-2018标准检测，GB/T18641-2018第三方检测机构

GB/T 18641-2018《伪狂犬病诊断方法》标准检测的核心要点如下：

一、标准背景与适用范围

发布与实施：GB/T18641-2018标准于2018年9月17日发布，2019年4月1日实施，替代了旧版GB/T 18641-2002标准。

适用范围：本标准适用于猪、牛、羊、犬、猫及其他易感动物的伪狂犬病诊断、检疫、免疫抗体评估和流行病学调查。

二、血清学检测方法

血清中和试验

原理：基于病毒与血清中特异性抗体的相互作用，通过观察细胞是否出现病变来判断血清中是否含有能够中和病毒的抗体。

操作：采用固定病毒稀释血清法，使用PK-15细胞系进行病毒培养和血清中和抗体效价的测定。

判定：按Reed-Muench法计算中和效价，≥1:2判为阳性。该试验特异性强，是国际贸易中通用的法定方法，用于口岸进出口检疫。

乳胶凝集试验

原理：利用乳胶颗粒表面的抗原与血清中的抗体发生凝集反应，通过肉眼观察凝集现象来判断结果。

操作：待检血清与抗原等量混合后，在载玻片上旋转混匀1-2分钟，观察凝集程度。

判定：≥50%凝集为阳性。该试验简便快速，敏感性高，适用于基层单位对该病的现场检测和筛查。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

gB-ELISA：S/N值<0.6为阳性，用于检测疫苗免疫抗体。

gE-ELISA：S/N值<0.6为阳性，用于野毒感染鉴别诊断。

类型：包括全病毒抗原ELISA（PrV-ELISA）、gB-ELISA和gE-ELISA等方法。

原理：在固体载体上以物理方法将抗体（或抗原）进行吸附，随后在此固相载体上进行一系列免疫学和酶促生化反应。

操作：按照试剂盒说明书进行操作，包括包被、封闭、加样、孵育、显色等步骤。

判定：

特点：特异、敏感、快速、简便，适用于实验室开展大批血清样品抗体检测。

三、病原学检测方法

病毒分离鉴定

原理：采用BHK-21/PK-15细胞系，对病料进行研磨、冻融、离心等处理后接种细胞，观察细胞病变（CPE）判断结果。

操作：病料需经严格处理以去除杂质和细菌，接种后每日观察细胞病变，对于含毒量低的样本需盲传2-3代。

判定：观察到CPE后，需进行免疫荧光染色（IFA）或病毒中和试验（VNT）进行鉴定确证。

地位：病毒分离鉴定是诊断伪狂犬病的“金标准”，具有的法定地位。

聚合酶链式反应（PCR）

gD基因检测（通用型）：上游引物P1：5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'，下游引物P2：5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'。

gE基因检测（野毒鉴别）：上游引物P3：5'-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3'，下游引物P4：5'-TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3'。

原理：针对伪狂犬病病毒的特定基因设计引物，通过PCR扩增检测病毒核酸。

操作：包括核酸提取、PCR扩增、电泳检测等步骤。

判定：凝胶电泳出现预期大小条带为阳性，但需警惕非特异性扩增，建议对阳性或可疑产物进行测序确证。

特点：快速、灵敏，可同时检测大批样品，但需注意样品交叉污染。

引物设计：

四、其他检测方法

家兔接种试验：使用抗体阴性健康家兔，接种后48小时内出现局部奇痒症状视为阳性。该试验需在有隔离和消毒条件的动物房中进行。

五、标准实施的意义

提高诊断准确性：通过规范检测方法和流程，确保诊断结果的准确性和可靠性。

指导疫情防控：为伪狂犬病的防控提供科学依据，有助于及时发现疫情并采取有效措施防止疫情扩散。

促进国际贸易：作为国际贸易中通用的法定方法，有助于保障我国动物及其产品的出口顺利进行。