血清血液非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法T/CVMA5-2018标准检测，血清血液第三方检测机构
- 供应商
- 安徽量科检测技术有限公司
- 认证
- 报价
- ￥100.00元每样品
- 资质
- CMA CNAS
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- 7-10工作日左右
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- 全国
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- 所在地
- 安徽省合肥市蜀山区蜀山经济开发区湖光路自主创新产业基地三期
- 更新时间
- 2026-03-22 07:00
T/CVMA 5-2018标准针对血清血液中非洲猪瘟病毒的实时荧光PCR检测，核心要点如下：
标准定位与背景
T/CVMA5-2018是由中国兽医协会制定的团体标准，旨在规范非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测技术，适用于猪脾脏、淋巴结、血液等样本中病毒核酸的检测。该标准于2018年10月24日实施，2019年3月对下游引物序列进行了勘误修正，确保检测准确性。
检测靶标与引物设计
上游引物（ASF-OIE-rPCRF）：5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'
下游引物（ASF-OIE-rPCRR）：5'-GATACCACAAGATCRGCCGT-3'（勘误后修正序列）
荧光探针（ASF-OIE-Probe）：5'-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-3'
靶基因：针对非洲猪瘟病毒VP72基因的保守区域设计引物和探针，确保检测的特异性和灵敏度。
引物序列：
设计依据：引物和探针设计参考世界动物卫生组织（OIE）推荐方案，符合PCR扩增的5'→3'方向原则，提高退火效率约17%，降低非特异性扩增风险。
检测流程与操作步骤
反应体系：20μL反应液，含2×PCR预混液、引物探针混合液、DNA模板和无核酸酶水。
反应程序：预变性95℃/3分钟；循环阶段（45个循环）95℃/15秒、52℃/10秒、60℃/35秒，在60℃退火延伸时收集荧光信号。
荧光通道选择：FAM通道检测病毒，HEX/VIC通道检测内标（如设置）。
使用商品化病毒DNA提取试剂盒或按标准配制试剂提取核酸，确保操作规范，避免交叉污染。
采集猪的脾脏、淋巴结、血液等样本，冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。
样本处理需在生物安全二级实验室完成，取组织或血粉制成匀浆，离心取上清液，60℃灭活30分钟。
样本采集与处理：
核酸提取：
实时荧光PCR反应：
结果判定与质量控制
分区操作：严格遵循试剂准备区、样本处理区、扩增分析区三区分离。
防污染措施：使用带滤芯吸头，实验后用10%次擦拭台面。
人员防护：在生物安全二级实验室进行，穿戴个人防护装备。
阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立。
阈值线设定原则：超过阴性对照扩增曲线的Zui高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点。
Ct值判定：
阳性：Ct值≤38.0且出现典型扩增曲线。
阴性：无Ct值或Ct值≥38.0且内标正常。
可疑：Ct值35-38.0，需重复检测或采用其他方法确认。
结果分析条件设定：
实验有效性判定：
质量控制要点：
实验室生物安全要求
生物安全级别：涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在动物生物安全三级实验室进行，实验室生物安全管理要求见GB19489。
废弃物处理：使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃；剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。
标准实施的意义
提高检测准确性：通过规范引物设计、反应体系和结果判定标准，确保检测结果的可靠性和重复性。
指导疫情防控：为非洲猪瘟的早期诊断、疫情监测和流行病学调查提供科学依据，有助于及时采取防控措施，降低疫病传播风险。
促进国际贸易：符合国际贸易规则和标准，保障我国生猪及其产品的出口，促进国际贸易的顺利进行。