狂犬病毒检测方法GB/T 14926.56-2008第三方检测机构，GB/T 14926.56-2008标准检测

GB/T 标准规定了狂犬病病毒（RV）的检测方法，主要采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行血清学检测，以下是该标准检测方法的详细介绍：

一、检测原理

在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，Zui后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性检测。

二、主要试剂和器材

1. 试剂：

2. 犬狂犬病毒IgG抗体检测试剂盒（定性），包括预包被狂犬病毒抗原的微孔板、狂犬病毒IgG酶标记物、狂犬病毒IgG阳性对照、狂犬病毒IgG临界对照、狂犬病毒IgG阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、10倍浓缩洗涤液、样品稀释液等。

3. 器材：

4. 精密移液器（10μL～100μL）

5. 一次性移液器吸头

6. 振荡器

7. 酶标仪（含450nm波长滤光片）

8. 37℃恒温培养箱

9. 吸水纸

三、检测步骤

1. 样品准备：将采集到的待检犬血液样品离心，分离出待检犬血清或血浆。应避免使用染菌、溶血和高血脂的样品；室温保存样品不应超过8小时，若试验在8小时以后进行，需将样品保存在2℃～10℃，如保存超过一周，则应保存在-20℃并避免反复冻融。

2. 试剂配置：将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并振摇，然后用去离子水或蒸馏水作10倍稀释。

3. 稀释样品：将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做1:10稀释，即取50μL血清或血浆加入到500μL样品稀释液中，并充分混匀。

4. 加样：取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，依次加入稀释好的样品，100μL/孔，然后将阳性、阴性对照各加1孔，临界对照加3孔，100μL/孔，另留一孔不加样品作为空白对照，在记录纸上记录各样品和对照的次序或位置，剩余的板条放入密封袋中保存。

5. 孵育：加样完成后，用封板膜盖板条，置37℃恒温培养箱中孵育30分钟。

6. 洗板：甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留1分钟后甩净、拍干，如此重复洗涤3次。

7. 加酶：除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物1滴（50μL），置37℃恒温培养箱孵育30分钟。

8. 显色：重复步骤6洗板3次，拍干后每孔（含空白对照孔）垂直滴加显色液A、B液各1滴，置37℃恒温培养箱避光显色10分钟。

9. 终止：每孔（含空白对照孔）立即加入终止液1滴，混匀后以空白孔调零，用酶标仪450nm波长测定A值。

四、结果判定

1. 试验有效性判定：以空白孔调零，阴性对照值小于等于0.10，临界对照A值应在0.15～0.40之间，证明试验成立。

2. 样品结果判定：

3. 待检样品A值大于等于临界对照A值的平均值，判为阳性。

4. 待检样品A值小于临界对照A值的平均值，判为阴性。

五、结果解释

1. 基础级犬：接种疫苗后，经ELISA检测抗体效价达到阳性值判为合格。

2. SPF级犬：不应进行疫苗接种，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性则判为阳性。

3. 基础级犬群体免疫抗体合格率：免疫抗体合格率=（被检动物抗体阳性数/被检动物总数）×。基础级犬群体免疫抗体合格率达到70%以上可判为该犬群免疫合格。