疟原虫Real-time PCR检测标准操作规程第三方检测机构，疟原虫Real-time PCR检测标准操作规程国标检测

疟原虫 Real-time PCR 检测标准操作规程国标文件，具体如下：

一、适用范围

本标准操作规程适用于疟原虫（包括间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫）的 Real-time PCR 检测。

二、检测原理

针对疟原虫基因设计特异性引物和探针，在反应体系中含有疟原虫基因 DNA 模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

三、主要组成成分

1. 疟疾通用 PCR 反应液：包含 Taq 酶、UNG 酶、dNTPs、缓冲液等。

2. 疟疾通用阳性对照：含疟原虫靶基因的质粒。

3. 疟疾通用阴性对照：灭菌纯水。

四、储存条件及有效期

1. 储存条件：避光 -20℃ 以下保存，避免反复冻融。

2. 有效期：12 个月。

五、适用仪器

ABI 系列、Bio-Rad 系列、Agilent Stratagene MX 系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量 PCR 仪。

六、操作步骤

1. 样本采集：

2. 采集部位：耳垂或指尖采血。

3. 注意事项：避免标本间交叉污染。标本收集后若不能立即检测，可置于 2～8℃ 冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于 -20℃～-80℃。

4. 样本处理：

5. 从冰箱中取出试剂盒，取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

6. 核算当次实验所需要的反应数（n），n = 阴性对照数（1T）+ 阳性对照数（1T）+ 误差预留量（1T）+ 样本数。

7. 在无菌离心管中加入 PCR 反应液（UNG 酶及 Taq 酶），充分混匀后瞬时离心。按照 20μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。

8. 盖紧 PCR 反应管盖后将 PCR 反应管转移至样本处理区。剩余试剂放回 -20℃ 以下冰箱冷冻保存。

9. 用 DNA/RNA 提取试剂盒提取核酸，具体操作按照其试剂盒说明书进行。

10. PCR 扩增：

11. 反应体积：25μL

12. 通道选择：FAM 通道采集疟疾通用荧光信号

13. PCR 反应条件：

14. UNG 处理：37℃ 2 分钟

15. 预变性：95℃ 3 分钟

16. PCR 扩增：95℃ 5 秒，57℃ 1 分 31 秒，45 个循环

17. 25℃ 30 秒

18. 在上述制备好的 PCR 反应样本管中分别加入处理好的待测标本 DNA 各 5μL，终体积 25μL/管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。

19. 阴性对照和阳性对照管则各加 5μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为 25μL/管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。

20. 取样本处理区准备好的 PCR 反应管，放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

21. 设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增：

七、结果判定

1. 阳性对照：有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值≤35。

2. 阴性对照：Ct 值>38 或无 Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

3. 标本检测结果：

4. 阳性：标本检测结果 Ct 值≤35 或有明显指数增长期。

5. 可疑：标本检测结果 Ct 值在 35～38 范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果 Ct 值仍在 35～38 范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

6. 阴性：标本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

八、检验结果的解释

1. 阳性（+）：标本中检测出疟疾通用 DNA。

2. 阴性（-）：标本中未检出疟疾通用 DNA。

九、注意事项

1. 使用本试剂盒的实验室，应严格按照国家有关部门颁布的有关基因扩增检验实验室管理规范进行管理。

2. 为避免 RNA 降解，样本处理过程应在 0-4℃ 条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3. 各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染；检测结束后，应立即对工作台清洁。

4. 吸取反应液时，应尽量避免产生气泡；上 PCR 仪前，应注意检查各反应管是否盖紧，以免液体蒸发造成结果不准确。

5. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。

6. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。

7. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触 PCR 反应管，并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记。

8. 检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有 10%次氯酸的废物缸内，检测结束的 PCR 反应管，切忌开盖，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃；工作台及各种实验用品应定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外灯进行消毒。

9. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用；并在有效期内使用。