消毒产品消毒技术规范(2002年版).3.8.5 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验第三方检测机构

《消毒技术规范》（2002 年版）2.3.8.5哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验国标检测是用于检测消毒产品遗传毒性的重要试验，以下是对该试验的详细介绍：

一、试验目的

利用细胞遗传学方法检测实验动物骨髓细胞染色体畸变率，以评价消毒剂的致突变性。

二、试剂准备

1. 阳性对照物：常用环磷酰胺、丝裂霉素 C 等。

2. 秋水仙素：取 40mg 秋水仙素溶解于 100ml 无菌的 0.85% 氯化钠溶液中，过滤除菌，配制成 0.04%的秋水仙素溶液。

3. 氯化钾溶液：0.075mol/L。

4. 固定液：甲醇/冰醋酸（3:1，V/V），临用现配。

5. 姬姆萨染液：按特定方法配制，用于染色体的染色。

6. 磷酸盐缓冲液：1/15mol/L，pH7.4。

三、实验动物与分组

1. 实验动物：选用健康成年大鼠或小鼠，体重 25g~30g（大鼠）或 180g~220g（若选用大鼠）。

2. 试验分组：随机分为 5 组，至少 3 个受试物剂量组（如1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50），另设阳性对照组和阴性（溶剂）对照组，每组 6只动物，雌雄各半。若采用一次Zui大限度试验，测得 LD50 大于 5000mg/kg 体重，即以 5000mg/kg体重为高剂量。

四、操作程序

1. 染毒方式：采用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔 24h。于第二次染毒后 6h 处死动物。处死动物前 2h~4h 腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为 4mg/kg 体重。

2. 样本采集与处理：

3. 用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剔除肌肉等组织。

4. 剪去股骨两端，用注射器吸取 5ml 生理盐水，从股骨一端注入，用 10ml 离心管从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。

5. 将骨髓细胞悬液离心（1000r/min，5min~7min），除上清液。加 0.075mol/L 氯化钾溶液7ml，用滴管将细胞轻轻混匀，置 37℃水浴中低渗处理 7min。

6. 加入 2ml 甲醇/冰醋酸固定液，混匀。离心（1000r/min，5min~7min），弃上清液。再加入 7ml固定液，混匀，固定 7min。离心（1000r/min，7min），弃去上清液。

7. 用同法再固定 1 次~2 次，弃上清液，加入数滴新鲜固定液，混匀。

8. 染色体标本制备与观察：

9. 用混悬液滴片，自然干燥。

10. 用姬姆萨染液染色，观察和记录染色体结构的异常和数量的异常。

五、观察指标与结果分析

1. 观察指标：每组各选 100个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析。染色体结构异常可有断裂、微小体、有着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙、粉碎化等。

2. 结果分析：

3. 计算畸变细胞率：畸变细胞率为 100个中期分裂相细胞中有染色体畸变的细胞数。一个中期分裂相细胞出现两种或多种畸变，仍按一个有染色体畸变细胞计。

4. 阳性与阴性（溶液）对照组的操作程序同试验组。只是阳性组选用环磷酰胺（40mg/kg体重）或丝裂霉素（1.5mg/kg~2.0mg/kg 体重）作为受试物的替代物。

六、评价规定

用 χ²检验或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性（溶剂）对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组畸变细胞率增加有显著性意义，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。