消毒产品消毒技术规范(2002年版)2.3.8.8 睾丸生殖细胞染色体畸变试验第三方检测机构

《消毒技术规范》（2002 年版）2.3.8.8 睾丸生殖细胞染色体畸变试验国标检测内容如下：

一、试验目的

利用细胞遗传学方法，以哺乳动物体内试验检测受试物引起的生殖细胞染色体损伤。试验有小鼠精原细胞染色体畸变试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验，可根据情况选做其一，或两者均做。

二、试剂准备

1. 受试物：用水、植物油配成溶液，或用 0.5% 羧甲基纤维素钠制成混悬液。

2. 阳性对照物：常用环磷酰胺，或丝裂霉素。

3. 秋水仙素（0.04%）：取 40mg 秋水仙素，溶于 100ml 0.85% 氯化钠溶液中，过滤除菌。

4. 甲醇/冰醋酸（3:1，V/V）固定液：临用现配。

5. 枸橼酸三钠。

6. 姬姆萨染液。

三、实验动物与分组

1. 实验动物：选用 3 月~4 月龄，体重 25g~30g 的雄性小鼠。动物总数不少于 25 只。

2. 试验分组：受试物至少设 3 个试验剂量组，每个剂量组 5只动物。另设阳性对照组和阴性（溶剂）对照组。阳性对照组用环磷酰胺（40mg/kg 体重）或丝裂霉素 C（1.5mg/kg~2mg/kg体重），腹腔注射。

四、操作程序

1. 小鼠精原细胞染色体畸变试验：

2. 用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔 24h。

3. 于第二次染毒后 6h 处死动物。处死动物前 3.5h~5.0h 腹腔注射 0.04% 秋水仙素溶液，剂量为 4mg/kg体重。

4. 小鼠精母细胞染色体畸变试验：

5. 灌胃染毒，每天 1 次，连续 5d。

6. 于第 1 次染毒后的第 12d~14d 将受试动物处死。处死动物前 3.5h~5.0h，腹腔注射 0.04%秋水仙素溶液（4mg/kg 体重）。

7. 样本处理：

8. 用颈椎脱臼法处死小鼠，取睾丸，去除脂肪。置含 2.2% 枸橼酸三钠溶液平皿中去除睾丸被膜，用针头使曲精小管松散。

9. 用吸管尽可能去除 2.2% 枸橼酸三钠溶液，将曲精小管置于含 3ml~4ml 低渗液（1% 枸橼酸三钠）的试管中。10min后更换低渗液，以去除碎片和精子。在室温下，低渗时间总计不超过 25min。低渗结束后去除低渗液。加入预冷的固定液（甲醇/冰醋酸），固定10min 后，更换固定液，再固定 10min。第 3 次固定至少 30min，也可在冰箱中过夜。

10. 用镊子将已固定的曲精小管移到含 50% 醋酸 5ml的离心管中，吸管吹打至不透光，离心（1000r/min，5min）。

11. 将固定液 1.0ml~1.5ml 加至离心所得细胞沉淀物中。滴管吹打后，滴 2 滴至用 70%乙醇浸湿的玻片，分散后，热风干燥。

12. 用姬姆萨应用液在室温染色 10min，自来水淋洗两次。

13. 显微镜检查：

14. 以油镜检查染色体结构的异常情况。每只动物做两个睾丸，每个睾丸分析 50 个中期分裂相精原细胞（或精母细胞）。

15. 记录观察染色体型和染色单体型染色体的结构异常。对精母细胞染色体还观察相互易位、X-Y和常染色体的单价体。检查染色体数目异常时，记录非整倍体和多倍体。在小鼠精母细胞染色体畸变试验时，只有当第一次减数分裂中，四倍体生殖细胞有一个被确认为四价体时才有意义。

五、评价规定

用 χ2检验，或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性（溶剂）对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著性意义的增加，经重复试验证实后，可判为该受试物对哺乳动物睾丸细胞具有致突变性。