消毒产品消毒技术规范(2002年版)2.3.8.2 V79 细胞基因突变试验第三方检测机构

《消毒技术规范》（2002年版）2.3.8.2V79细胞基因突变试验标准检测是用于评估消毒剂等化学物质致突变性的一种体外遗传毒性测试方法，以下是其详细介绍：

一、试验原理

细胞在正常培养条件下，对6-硫代鸟嘌呤（6-TG）的毒性作用敏感，不能生存。在致癌物和/或致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6-TG的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。

二、试验材料

1. 细胞系：中国仓鼠肺（V79）细胞株。

2. 培养液：采用EagleZui低必需培养液（EMEM）或DulbeccoZui低必需培养液（DMEM）等，并加入10%小牛血清以及青霉素（100IU/ml）和链霉素（100μg/ml）。

3. 受试物：能直接溶于无血清完全培养液内。否则，需先溶于二甲基亚砜（DMSO），而后加于完全培养液内。所加DMSO溶液量应低于1.0%（V/V）。

4. 阳性对照物：加S9时选用环磷酰胺等，不加S9时选用丝裂霉素C等。

5. 其他试剂：包括小牛血清、无钙镁磷酸缓冲液、秋水仙素溶液、氯化钾溶液、甲醇/冰醋酸固定液、姬姆萨染液等。

三、试验步骤

1. 细胞准备：为减少自发突变，正式试验前将野生型细胞接种于含THMG的MEM培养液内并在二氧化碳培养箱中培养一周，以杀灭自发HGPRT位点突变体。随后重新接种于MEM培养液中。

2. 细胞接种：表达结束后，消化细胞，分别接种，每组5个平皿，每平皿种2×105个细胞。

3. 加入6-TG：待细胞贴壁后加入6-TG，终末浓度为5μg/ml。放入二氧化碳培养箱培养7d~10d。

4. 固定与染色：固定后进行姬姆萨染色，计数平皿内集落数，并计算其突变频率（MF）。

5. 对照组操作：阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性（溶剂）对照组用受试物溶剂代替受试物。另设一阴性（未处理）对照组。

四、结果评价

1. 自发突变频率范围：对V79细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为10/106~100/106个存活细胞。

2. 统计学处理：用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组MF与阴性（溶剂）对照组者相比，突变率有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对V79细胞HGPRT系统有致突变性。