在《消毒技术规范(2002年版)》中,狂犬病毒定量灭活试验含中和剂鉴定主要遵循病毒灭活试验和中和剂鉴定试验的相关规定,通过细胞感染法测定消毒因子对狂犬病毒的灭活效果,并确保中和剂能有效中和消毒剂且对病毒和细胞无不良影响。以下是具体检测流程和要点:
一、病毒灭活试验
试验原理:用细胞感染法测定消毒因子作用前后(或对照组与实验组)样本中病毒的量。以细胞病变作为判断指标,确定各组病毒的感染滴度,观察消毒因子对病毒的灭活效果。
试验分组:
试验组:根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计,设定适宜的浓度与作用时间组(不少于1个浓度,3个作用时间),对作用时间的设计应不短于30s。
阳性对照组:用去离子水代替消毒剂,按试验组规定步骤加入病毒悬液进行试验和培养,观察病毒生长是否良好。
操作步骤:
病毒悬液的制备:取出低温保存的狂犬病毒,室温解冻后,与设定浓度的有机干扰物混合作为消毒剂灭活试验用病毒悬液。
消毒试验:取病毒悬液加入待检消毒剂,立即混匀并记时。作用至规定时间,立即取出部分样液,加入经鉴定合格的中和剂中混匀;或用经鉴定合格的除药方法处理。
对照组试验:阳性对照组为病毒对照组,观察病毒生长是否良好,病毒滴度是否达到试验要求;阴性对照组用细胞维持液作为阴性对照,观察有无污染,细胞生长是否良好。
病毒滴度测定:以上各组按照终点稀释法分别进行病毒滴度测定。试验重复3次。
结果评价:悬液灭活试验中,每次试验对病毒应有效灭活,阳性对照组病毒滴度对数值应达到一定要求(如≥5.0)。
二、中和剂鉴定试验
试验目的:确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。
试验设计原则:
通过所设各组试验结果综合分析,确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用,对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。
中和试验用消毒剂浓度应为正式消毒试验Zui高浓度,作用时间Zui短不得少于30s。试验重复3次。
试验分组:
中和剂+病毒悬液→接种细胞培养:观察中和剂对病毒有无抑制作用。
(消毒剂+中和剂)+病毒悬液→接种细胞培养:观察中和产物或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。
病毒悬液→接种细胞培养:观察病毒是否可正常生长,并将其结果作为阳性对照值。
未接种病毒的细胞→培养:观察细胞生长是否正常。
中和剂+细胞→培养:观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。
(消毒剂+中和剂)+细胞→培养:观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。
消毒剂+细胞→培养:观察消毒剂对细胞生长有无影响。
预备试验分组:
正式试验分组:
结果评价:试验结果符合以下全部条件,所测中和剂可判为合格:
正式试验中特定组无试验病毒或仅有少量试验病毒生长。
正式试验中特定组有较其他组显著为多,但较其他组显著为少的试验病毒生长。
正式试验中特定组病毒生长与原接种量相近。
正式试验中细胞生长正常组细胞生长正常。
预备试验结果显示,中和剂和中和产物在正式试验的Zui高浓度下对细胞生长无影响。
连续3次试验取得合格评价。
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