Gao antibody 武汉纽斯特生物公司
- 供应商
- 武汉纽斯特生物技术有限公司
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- 联系电话
- 15002729010
- 手机号
- 15002729010
- 联系人
- 黄经理
- 所在地
- 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号光谷生物城B3-3栋3楼
- 更新时间
- 2021-11-30 17:11
检测步骤
Ι。活性cdc42 pull-down实验
1. 等分0.5-1 ml的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 缓冲液。
3. 向管中加入1ul的活性cdc42单克l隆抗l体。
4. 用涡旋振荡仪将protein a/g凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
5. 将管置于4°c条件下孵育1h，并轻轻的进行摇动。
6. 5000g，离心1分钟。
7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
8. 用0.5 ml的1x assay/lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
10. 用20ul的2x sds-page样品缓冲液重悬样品。
11. 样品煮沸5min。
12. 5000g，离心10s。
悬浮细胞
1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂刺激。
2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。
3.吸出培养基，并用冰冷的pbs洗涤两次。
4.完全除去pbs洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1x分析/裂解缓冲液
（每1 x 107池0.5 – 1 ml）。
5.通过重复移液裂解细胞。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，gao antibody，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这
发生时，裂解液可通过27?号注射l器针头3-4次以剪切
基因组dna。
8.通过离心10分钟（在4°c下为12，000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-
70°c以备将来使用。
阳性和阴性对照的体外gtpγs/ gdp蛋白质上样量
注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用rab35，而
体外gtpγs蛋白负载将激l活近90％的rab35。
1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的rab35蛋白）。
2.向每个试管中加入20 μl 0.5 m edta（至20 mm终浓度）。
3.将5 μl 100 xgtpγs（至100 μm，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4.在第二个试管中加入5 μl 100 x gdp（至1 mm，终浓度）（阴性对照）。
5.在搅拌下将试管在30°c孵育30分钟。
6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2（至60 mm）。
1.抗活性的arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于ph 7.4的pbs中的22 μl（1mg/ ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的arl1-gtp。
2.蛋白a / g琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μl 50％浆液。
3. 5x测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 ml的250 mm tris-hcl，ph 8，750mmnacl，50 mm mgcl2，5 mm edta，5％triton x-100。
4.抗arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μl（1 mg / ml）
ph 7.4的pbs中含有50％的甘油。
5. 100 xgtpγs（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mm，使用5 μlgtpγsgtp标记的0.5 ml细胞裂解物。
6. 100 x gdp（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mm，使用5 μl gdp
gdp标记的0.5 ml细胞裂解物。
1.刺激的和非刺激的细胞裂解液
2.蛋白酶抑制l剂
3. 4°c管摇杆或摇床
4. 0.5 m edta，ph8.0
5. 1 m氯化镁
6. 2倍还原sds-page样品缓冲液
7.电泳和免l疫印迹系统
8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如tbst（10 mm tris-hcl，ph 7.4，0.15 mnacl，0.05％tween-20）
9.免l疫印迹封闭缓冲液（tbst包含5％脱脂奶粉或3％bsa）
10. pvdf或硝l酸纤维素膜
11.二抗
12. ecl检测试剂
?1x测定/裂解缓冲液：短暂混合5x储备液，并在去离子水中稀释至1x。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mmpmsf，10 μg / ml亮肽素和10 μg / ml抑肽酶。
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