Gao kit 武汉纽斯特

检测步骤

Ι。活性cdc42 pull-down实验

1. 等分0.5-1 ml的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 缓冲液。

3. 向管中加入1ul的活性cdc42单克l隆抗l体。

4. 用涡旋振荡仪将protein a/g凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

5. 将管置于4°c条件下孵育1h，并轻轻的进行摇动。

6. 5000g，离心1分钟。

7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

8. 用0.5 ml的1x assay/lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2x sds-page样品缓冲液重悬样品。

11. 样品煮沸5min。

12. 5000g，离心10s。

 1.抗活性的arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于ph 7.4的pbs中的22 μl（1mg/ ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的arl1-gtp。

2.蛋白a / g琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μl 50％浆液。

3. 5x测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 ml的250 mm tris-hcl，ph 8，750mmnacl，50 mm mgcl2，gao kit，5 mm edta，5％triton x-100。

4.抗arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μl（1 mg / ml）

ph 7.4的pbs中含有50％的甘油。

5. 100 xgtpγs（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mm，使用5 μlgtpγsgtp标记的0.5 ml细胞裂解物。

6. 100 x gdp（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mm，使用5 μl gdp

gdp标记的0.5 ml细胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°c管摇杆或摇床

4. 0.5 m edta，ph8.0

5. 1 m氯化镁

6. 2倍还原sds-page样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如tbst（10 mm tris-hcl，ph 7.4，0.15 mnacl，0.05％tween-20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（tbst包含5％脱脂奶粉或3％bsa）

10. pvdf或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ecl检测试剂

?1x测定/裂解缓冲液：短暂混合5x储备液，并在去离子水中稀释至1x。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mmpmsf，10 μg / ml亮肽素和10 μg / ml抑肽酶。

arl3（类似arf的3）是一种adp-核糖基化因子（arf）家族蛋白，在n端延伸方面不同于大多数arf家族成员。arl3的核苷酸交换是快速的，并且与脂质和去污剂无关。 与gdt /gtp结合后，arl3与一系列效应蛋白相互作用，并调节这些效应蛋白的活性，例如人类视网l膜基因4（hrg4），cgmp磷酸二酯酶的δ亚基（pdeδ）和arl2的结合物（bart）。arl3还以可调节的方式结合微管，以通过与色素性视网l膜炎2（rp2）相互作用来改变胞质分裂的特定方面。有人提出，rp2与arl3协同作用，将光感受器中的细胞膜和细胞骨架连接为细胞的一部分

9.收集上清液并在冰上存储样品（约1-2 mg总蛋白）以进行中间使用，或将其冷冻并保存在-70°c下以备将来使用。

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