Gaz 蛋白 武汉纽斯特生物公司

 1.抗活性的arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于ph 7.4的pbs中的22 μl（1mg/ ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的arl1-gtp。

2.蛋白a / g琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μl 50％浆液。

3. 5x测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 ml的250 mm tris-hcl，ph 8，750mmnacl，50 mm mgcl2，5 mm edta，5％triton x-100。

4.抗arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μl（1 mg / ml）

ph 7.4的pbs中含有50％的甘油。

5. 100 xgtpγs（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mm，使用5 μlgtpγsgtp标记的0.5 ml细胞裂解物。

6. 100 x gdp（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mm，使用5 μl gdp

gdp标记的0.5 ml细胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°c管摇杆或摇床

4. 0.5 m edta，ph8.0

5. 1 m氯化镁

6. 2倍还原sds-page样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如tbst（10 mm tris-hcl，ph 7.4，0.15 mnacl，0.05％tween-20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（tbst包含5％脱脂奶粉或3％bsa）

10. pvdf或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ecl检测试剂

?1x测定/裂解缓冲液：短暂混合5x储备液，并在去离子水中稀释至1x。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mmpmsf，10 μg / ml亮肽素和10 μg / ml抑肽酶。

试剂制备

1x assay/lysisbuffer：实验前用去离子水将5x的assay/lysis缓冲液稀释成1x的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mmpmsf， 10 μg/ml leupeptin（亮肽素），或 10 μg/ml aprotinin（抑肽酶）。

样品处理

贴壁细胞

1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制l剂进行处理。

2. 吸去培养基并用冰冷的pbs洗涤两次。

3. 向细胞中加入1x assay/lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1ml）。

4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7.如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组dna，从而避免上述情况的出现。

8. 4°c 12000 g， 离心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°c条件下。

电泳和转移

1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μl/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色mw标准（作为成功转入的指标步骤3）。

2按照制造商的说明进行sds-page。

3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到pvdf或硝化纤维膜上说明。

免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1在电印迹步骤之后，将pvdf膜浸入甲l醇中15次

然后在室温下干燥5分钟。

如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。

2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在tbst中封闭1小时

不断地搅动。

用抗arl1单克l隆抗l体孵育，新鲜稀释1:50~1000

（取决于样品中arl1蛋白质的含量）5%脱脂奶粉或3%

bsa/tbst，室温下持续搅拌1-2小时或4o

过夜。

3用tbst清洗吸水膜三次，每次5分钟。

4用二级抗l体（例如山羊抗鼠igg，hrp结合物）培养膜，

在室温下，gaz 蛋白，在5%脱脂奶粉或3%bsa/tbst中新鲜稀释1:1000，1小时

不断地搅动。

5用tbst清洗吸水膜三次，每次5分钟。

6使用您选择的检测方法，如ecl。

gaz蛋白-武汉纽斯特生物公司(图)由武汉纽斯特生物技术有限公司提供。武汉纽斯特生物技术有限公司为客户提供“g蛋白活性,camp和cgmpelisa试剂盒,蛋白点突变”等业务，公司拥有“纽斯特”等品牌，专注于生物化工等行业。，在湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号光谷生物城b3-3栋3楼的名声不错。欢迎来电垂询，联系人：黄经理。