在《消毒技术规范》(2002版)中,白色念珠菌杀灭试验主要遵循以下规范和要求:
一、试验目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上白色念珠菌所需剂量,以作为确定实用消毒剂量的依据。
二、试验器材
白色念珠菌:ATCC10231。
中和剂:根据规范鉴定合格的中和剂,用于消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂。
培养基:沙堡氏琼脂培养基(用于培养白色念珠菌)。
其他器材:包括无菌试管、移液器、恒温培养箱等必要的试验器材。
三、试验步骤
菌悬液制备:
取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。
取含5.0ml~10.0ml沙堡液体培养基试管,滴入少许菌种悬液,置37℃培养18h~24h。
用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于沙堡琼脂培养基平板上,于37℃培养18h~24h。
挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于沙堡琼脂斜面,于37℃培养18h~24h,即为第3代培养物。
取第3代~6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h~24h),用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内,反复吹吸,洗下菌苔。随后,用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s,或在手掌上振敲80次,以使白色念珠菌悬浮均匀。
悬液杀菌试验时,实验用菌悬液的含菌量为1×10⁷cfu/ml~5×10⁷cfu/ml。
试验分组:
试验组:按消毒剂对所试菌种的杀灭能力,选定3个消毒剂浓度和4个作用时间进行试验,共为12个剂量。
阳性对照组:以标准硬水代替消毒剂溶液,按试验组规定程序测定菌液在加入标准硬水后,所含白色念珠菌的浓度。以该结果作为阳性对照。
阴性对照组:观察所用中和剂、标准硬水和培养基有无污染,共3组。
杀灭试验:
常用杀灭试验有悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验等。
按规范程序进行试验,包括加入消毒剂、中和剂、培养基等步骤,并置于适宜条件下培养。
效果评估:
在杀灭试验结束后,取适量处理后的菌液进行培养,观察并记录菌落生长情况。
通过比较处理组与对照组的菌落数差异,评估消毒剂的杀灭效果。
四、结果评价
产品监督检验:按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间,重复试验3次。对白色念珠菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00,可判定该产品对白色念珠菌污染物消毒合格。
产品申报卫生许可检验:按产品使用说明书指定的使用浓度和3个作用时间(Zui短作用时间的0.5倍、Zui短作用时间、Zui短作用时间的1.5倍),重复试验3次。在产品使用说明书规定使用浓度与Zui短作用时间,以及Zui短作用时间的1.5倍时,各次试验的杀灭对数值均应≥4.00。在产品使用说明书规定使用浓度与Zui短作用时间的0.5倍时,允许杀灭对数值<4.00,可判为实验室试验该产品对白色念珠菌污染物消毒的有效剂量。
五、注意事项
在杀菌试验中,每次均应设置阴性和阳性对照。对照组的结果关系到对整个结果的评价,故绝不可省略。
杀菌试验中组距的设置很重要。起始浓度和时间的高低或长短不当,难以找到所需的Zui低有效浓度或Zui短有效时间;组距过宽,所得结果的性差。因此,对于不熟悉的消毒剂应通过预备试验多做一些探索,以免去正式试验中不必要的反复。
试验过程中需严格遵守无菌操作原则,防止污染。
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