在《消毒技术规范》(2002版)中,针对黑曲霉菌的定量杀灭试验,主要遵循以下规范和要求:
一、试验目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上黑曲霉菌孢子所需剂量,以验证对黑曲霉菌及其孢子的实用消毒剂量。
二、试验器材
麦芽浸膏琼脂(MEA):用于培养黑曲霉菌。
试验菌:黑曲霉菌ATCC 16404或其孢子悬液与菌片。
中和剂:根据规范鉴定合格的中和剂,用于消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂。
其他器材:包括刻度吸管、恒温水浴箱、喷雾装置(用于喷雾消毒试验)、电动混合器、计时装置等。
三、试验步骤
菌悬液制备:
取冻干菌种管,以无菌操作打开,用毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中,轻轻吹吸,使菌种沉淀物融化分散。
取少许沉淀物悬液加到含麦芽浸膏营养肉汤培养基的试管中,置30℃±1℃培养42h~48h。
用接种环划线接种第1代培养物于MEA培养基平板,置30℃±1℃培养箱中培养42h~48h。
取平板培养物中的典型菌落,接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基,置30℃±1℃培养箱中培养42h~48h,即为第3代培养物。
制备孢子悬液时,需向罗氏瓶培养物中加入吐温80生理盐水溶液,刮洗黑曲霉菌分生孢子于溶液中,将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中,轻轻振摇后滤过除去菌丝。必要时进行离心处理以去除残留菌丝。
黑曲霉菌分生孢子悬液在2℃~8℃储存不能超过2d,使用前需混合均匀,并在显微镜下观察是否有孢子出芽。
悬液试验时,实验用菌悬液的含菌量为1×10⁷cfu/ml~5×10⁷cfu/ml。
试验分组:
试验组:按规范选定消毒剂浓度与作用时间,对受试菌种的杀灭能力进行测定。
阳性对照组:以标准硬水代替消毒剂溶液,按规范程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含实验菌的初始浓度,并以其计算消毒因子对实验菌的杀灭对数值。
阴性对照组:观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。
试验程序:
常用杀灭试验包括悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验等。
对黑曲霉菌,使用麦芽浸膏琼脂(MEA)进行培养。
活菌培养计数时,在30℃培养箱中培养72h观察Zui终结果。
四、结果评价
产品监督检验:
按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间,重复试验3次。
在悬液定量杀灭试验中,要求各次试验的杀灭对数值均≥4.00log₁₀,可判定该产品对黑曲霉菌污染物消毒合格。
在载体定量杀灭试验中,要求各次试验的杀灭对数值均≥3.00log₁₀,可判定消毒合格。
产品申报卫生许可检验:
按产品使用说明书指定的使用浓度和3个作用时间(Zui短作用时间的0.5倍、Zui短作用时间、Zui短作用时间的1.5倍),重复试验3次。
在产品使用说明书规定使用浓度与Zui短作用时间,以及Zui短作用时间的1.5倍时,各次试验的杀灭对数值均应≥4.00log₁₀。
在产品使用说明书规定使用浓度与Zui短作用时间的0.5倍时,允许杀灭对数值<4.00log₁₀,可判为实验室试验该产品对黑曲霉菌污染物消毒的有效剂量。
五、注意事项
黑曲霉菌试验操作应在生物安全Ⅱ级实验室内进行,避免造成环境污染和操作者受污染。
试验过程中需严格遵守无菌操作原则,防止污染。
试验用试剂和器材需提前置于规定温度的水浴箱内备用。
试验结束后需对试验区域进行彻底消毒处理。
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