pCas9 gRNA3基因敲除载体对照实验

实验原理

ptyne载体在egfp编码框上游有2个错码的atg起始密码子，由于不能有效地启动egfp表达，ptyne转染细胞仅能发出很微弱的荧光。

pcas9/grna3载体需要成对发挥作用。我们根据ptyne载体设计构建了pcas9/grna3阳性对照载体pcas9-pf、pcas9-pr。由于cas9nicknase对一个靶点切割后形成的dna单链断裂会被修复，几乎不会引起dna序列改变。我们用pcas9-pf与ptyne共转染作为阴性对照组，pcas9-pf、pcas9-pr与ptyne三个质粒共转染作为阳性对照组。pcas9-pf、pcas9-pr共同切割ptyne载体，使ptyne载体dna双链断裂，经细胞修复后，突变的ptyne将表达出读码框正确的egfp蛋白，发出明亮的绿色荧光。

pcas9/grna3阳性对照载体（pcas9-pf）靶序列：cgaagcttgagctcgagcca。

pcas9/grna3阳性对照载体（pcas9-pr）靶序列：taccgcgggcccgggatcct。

pf、pr靶点在ptyne载体上的位置:

cas9nicknase切割原理:

实验内容

1、实验材料

ptyne质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：cr1011）
pcas9-pf质粒（pcas9/grna3阳性对照，货号：cr1012，无内毒素试剂盒制备）
pcas9-pr质粒（pcas9/grna3阳性对照，货号：cr1012，无内毒素试剂盒制备）
polyfect-v转染试剂（货号：p2010-1）
293t细胞系

2、实验步骤

1)转染前24小时将293t铺到24孔板中。同时准备2个孔。

2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

3) 准备转染试剂稀释液：

polyfect-v转染试剂 3.2ul

dmem培养基 96.8ul

4)将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。

5) 将转染液加入293t细胞。

6) 48小时后检测egfp荧光表达。

实验结果