Cas9蛋白稳定表达细胞系Cas9对照实验

实验原理

ptyne载体在egfp编码框上游有2个错码的atg起始密码子，由于不能有效地启动egfp表达，ptyne转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据ptyne载体上错码的egfp的上游区域设计并构建了cas9蛋白基因敲除实验的阳性对照grna表达载体pgr-hygro-p。
ptyne载体和阳性对照grna表达载体共转染cas9表达细胞，grna指引cas9蛋白对ptyne载体上的错码egfp基因切割。细胞对断裂的dna进行修复，产生正确的egfp基因，发出明亮的绿色荧光。
通过ptyne载体实验可以检测cas9蛋白表达细胞系是否构建成功。

pgr-hygro-p阳性对照载体靶序列：cttcgaattctgcagtcga。该靶点位于ptyneegfp基因上游。

pgr-hygro-n阴性对照载体靶序列：atcgactagccactcagac。该序列为随机序列。

pgr-hygro-p靶点在ptyne载体上的位置:

cas9切割原理:

pgr-hygro载体图谱：

实验内容

1、实验材料

ptyne质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：cr1011）

pgr-hygro-p质粒（阳性对照，无内毒素试剂盒制备；货号cr1022）
pgr-hygro-n质粒（阴性对照，无内毒素试剂盒制备；货号cr1022）
cas9蛋白表达293t细胞系（货号：c1203）
polyfect-v转染试剂（货号：p2010-1）

2、实验步骤

1)转染前24小时将293t-cas9铺到24孔板中。同时准备2个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

3) 准备转染试剂稀释液：
polyfect-v转染试剂 3.2ul
dmem培养基 96.8ul
4)将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293t-cas9细胞。
6) 48小时后检测egfp荧光表达。

实验结果