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蛋白电泳问题处理

蛋白电泳中经常出现的问题和解决方法

1：“微笑”(两边翘起中间凹下)形带，主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所

致，多出现于较厚的凝胶中。    处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

2： “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：在两板间加入适量缓冲液，水平电泳槽报价，以排除气泡。

3：出现拖尾现象?

主要是样品融解效果不佳、样品降解或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心;选择适当的样品缓冲液；电泳缓冲液时间过长，重新配制

4：电泳的条带很粗?

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度;  保证浓缩 胶贮液的ph正确(6.7);适当降低电压

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转印电泳（湿转）实验的操作

转印电泳湿转方式的操作介绍

湿转（一般是恒压转印，100v，时间2h左右）：转印缓冲液，三明治结构 ，底层海绵，往上依次是3-4层滤纸，凝胶，膜，3-4层滤纸，海绵

海绵和滤纸在使用前要用转移液浸泡，在制作三明治结构时一定要避免凝胶干燥，水平电泳槽，滤纸内的气泡要用玻璃棒赶走

膜在用之前都要活化，水平电泳槽批发，pvdf膜要先浸泡5s-30s，然后在转移缓冲液中平衡，水平电泳槽生产厂家，目的是活化膜上的正电基团，nc膜直接在转移液中平衡即可

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蛋白凝胶电泳分为非变性凝胶和变性凝胶

所谓非变性凝胶，即在凝胶中不加sds和尿素等变性剂，这种凝胶中，蛋白质仍保持活性，其迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。

所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、sds(十二烷基磺酸钠)、dtt等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为sds。

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