食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB 4789.30-2016第三方检测机构

GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的检验方法，包括定性检验、平板计数法和MPN计数法，适用于不同类型食品中该菌的检测。以下是该标准的核心内容：

一、适用范围

第一法（定性检验）：适用于所有食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检测。

第二法（平板计数法）：适用于该菌含量较高的食品（如熟肉制品、乳制品）的定量检测。

第三法（MPN计数法）：适用于该菌含量较低（<100 CFU/g）且杂菌含量较高的食品（如牛奶、水、含颗粒物质的食品）的定量检测。

二、检验流程1. 增菌培养

前增菌：取25g（mL）样品加入225mL LB1增菌液（李氏增菌肉汤），均质后于30℃培养24h±2h。

选择性增菌：取0.1mL前增菌液转种至10mL LB2增菌液，30℃继续培养24h±2h。

2. 分离培养

选择性平板：

PALCAM琼脂平板：典型菌落为灰绿色，周围有棕黑色水解圈，部分菌落有黑色凹陷。

李斯特氏菌显色平板：根据产品说明判断菌落特征（如蓝色或蓝绿色菌落）。

培养条件：36℃±1℃培养24h~48h，观察菌落形态。

3. 初筛试验

从选择性平板上挑取3~5个典型或可疑菌落，分别接种木糖和鼠李糖发酵管，36℃培养24h±2h。

同时划线接种TSA-YE平板，36℃培养18h~24h，选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进行鉴定。

4. 鉴定试验

染色镜检：革兰氏阳性短杆菌，大小（0.4~0.5）μm×（0.5~2.0）μm，可出现轻微旋转或翻滚运动。

动力试验：穿刺半固体或SIM动力培养基，25℃~30℃培养48h，菌落呈伞状生长。

生化鉴定：

过氧化氢酶试验：阳性。

糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖阳性，甘露醇、木糖阴性（部分菌株可能例外）。

MR-VP试验：甲基红阳性，V-P阴性。

溶血试验：羊血琼脂平板上产生狭窄的β溶血环（斯氏李斯特氏菌溶血较弱，英诺克李斯特氏菌无溶血）。

5. 确认试验（可选）

协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上与金黄色葡萄球菌或马红球菌协同作用，观察溶血增强现象。

小鼠毒力试验：腹腔注射菌悬液，观察小鼠死亡情况（致病株2~5天内死亡）。

三、结果报告

定性检验：若所有选择性平板中均未检出目标菌，报告“25g（mL）样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌”；若检出，报告“25g（mL）样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌”。

定量检验：根据平板计数法或MPN计数法的结果，报告菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）或Zui可能数（MPN/g或MPN/mL）。

四、关键注意事项

培养基选择：PALCAM琼脂和显色平板可联合使用，提高检出率。

生化异常菌株：部分菌株可能不发酵鼠李糖或溶血不明显，需结合多项试验综合判断。

操作时间限制：从样品稀释到接种完毕不得超过45分钟（2025版新增要求）。

协调：限量要求与CAC/GL 61-2007一致，即食食品中n=5, c=0, m=0（25g）。

五、标准更新动态

2025版修订：

增菌液改为Fraser肉汤（FB1、FB2），提高检出率。

新增OA李斯特氏菌显色培养基，优化菌落识别。

强化纯化步骤，避免选择性培养基成分干扰。

新增操作时间限制和结果报告规范。