细胞毒性（MTT）检测是一种基于细胞代谢活性的经典实验方法，广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性评估及肿瘤药敏试验等领域。以下是对该检测方法的详细解析：
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二四氮唑溴化物）是一种黄色染料，具有细胞膜渗透性。其检测原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶活性：
活细胞：线粒体内的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），沉积在细胞中。
死细胞：因线粒体功能丧失，无法还原MTT，故无甲臜生成。
通过溶解甲臜结晶并测定其吸光度，可间接反映活细胞数量。吸光度值与活细胞数呈正相关，即甲臜结晶越多，吸光度越高，表明活细胞数量越多。
细胞准备：
选择合适细胞系（如肿瘤细胞系HeLa、A549或正常细胞系成纤维细胞），确保细胞处于对数生长期且无污染。
将细胞消化后制备成悬液，调整浓度至每孔1000-10000个细胞（具体数量根据细胞类型和实验目的确定）。
将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，边缘孔用无菌PBS或培养基填充以减少蒸发影响。
细胞培养：
将96孔板置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24-48小时，使细胞贴壁生长至单层铺满孔底。
受试物处理：
加入浓度梯度的受试物（如药物、化合物），一般设置5-7个梯度，每个梯度3-5个复孔。
继续孵育16-48小时（时间根据受试物性质和细胞类型调整）。
MTT反应：
每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL），继续孵育4小时。
若受试物与MTT反应，需先离心弃去培养液，用PBS冲洗2-3遍后加入含MTT的培养液。
溶解与测定：
终止培养后，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO）。
置摇床上低速振荡10分钟，使甲臜结晶充分溶解。
使用酶标仪在570nm波长处（参比波长630nm）测定各孔吸光值。
细胞存活率计算：
细胞存活率(%)=(对照组平均吸光度实验组平均吸光度)×
对照组为未经受试物处理的细胞，实验组为不同浓度受试物处理的细胞。
细胞毒性曲线绘制：
以受试物浓度为横坐标，细胞存活率或细胞毒性程度为纵坐标，绘制曲线。
细胞存活率越低，表明受试物细胞毒性越大。
优点：
灵敏度高：能检测到低浓度的细胞活性变化。
操作简便：步骤相对简单，无需复杂设备。
成本低廉：试剂和耗材价格较低。
适用性广：适用于多种细胞类型和实验条件。
缺点：
干扰因素多：细胞培养基组成、细胞释放的内含物（如裂解液、分泌物）及外部添加物（如金纳米粒子）可能影响MTT还原。
结果不一致性：与某些更敏感或无干扰的方法（如ATP测定法）相比，结果可能存在差异。
对特定药物反应性有限：如与多柔比星（DOX）和氟罗芬尼酮（FPh）共培养时，MTT法可能无法准确反映细胞存活率。
药物筛选：快速筛选出对细胞毒性较低的有效候选药物。
细胞增殖测定：评估细胞在特定条件下的增殖能力。
细胞毒性评估：检测化学物质、生物材料或药物对细胞的毒性作用。
肿瘤药敏试验：测定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
无菌操作：避免细菌污染影响实验结果。
MTT试剂保存：现用现配，过滤后4℃避光保存两周，-20℃长期保存，避免反复冻融。
避免血清干扰：高浓度血清可能影响吸光度值。
细胞接种密度：选择适当密度，细胞数过多敏感性降低，过少观察不到差异。
结果线性范围：MTT吸光度在0-0.7之间，以保证实验结果的线性。
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