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蜂蜜中D-松二糖含量的测定

D-松二糖是一种天然存在于蜂蜜中的还原性二糖，由一分子葡萄糖和一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成，是蔗糖的同分异构体，甜度为蔗糖的一半。D-松二糖具有容易结晶、高度可溶、水解速率慢，不会被致龋微生物发酵等特点，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用。在食品工业中具有广阔的应用前景，具有代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力。此外，D-松二糖还可以广泛应用于医药、化妆品等领域，是一种高附加值的产品。

测定方法

步骤1、内标物储备液的制备：准确称量邻苯二甲酸氢钾0.5g，置于5mL容量瓶中，加水定容至刻度，涡旋并超声均匀，制成1mL含100mg内标物的储备液；

步骤2、D-松二糖对照品溶液的制备：

(1)精密称取D-松二糖标准品100mg，置于5mL容量瓶中，用1mol/L KH2PO4缓冲液定容至5mL，涡旋均匀，制成每1mL中含20mgD-松二糖的储备液；

(2)分别精密吸取D-松二糖储备液100-1500ul，各置于5mL容量瓶中，分别依次加入含内标物10mg的内标物储备液100ul、1mol/L HCl200uL，用1mol/LKH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，分别制得每1mL中含D-松二糖对照品2-30mg的系列对照品溶液；

步骤3、样品溶液的制备：精密称取蜂蜜样品1g，置于5mL量瓶中，依次加入含内标物10mg的内标物储备液100uL、1mol/L HCl200uL，用1mol/L KH2PO4缓冲液溶解并定容至刻度，涡旋均匀，作为样品溶液；

步骤4、蜂蜜样品中D-松二糖的含量测定：分别吸取步骤2制备的系列D-松二糖对照品溶液及步骤3制备的样品溶液900ul，各加入含质量分数为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%的重水溶液100ul，涡旋均匀，各取600ul装入核磁管待测；

步骤5、核磁氢谱测定条件：脉冲程序为noesygpprld；01=4.7-4.8；NS=32；DS=4；D1=4s；TD=65536；SWH=8196.722Hz；TE=300.1K；

步骤6、蜂蜜样品中D-松二糖的含量计算：分别得到D-松二糖系列对照品溶液和样品溶液的核磁氢谱，在保持原始谱图不放大的前提下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录对照品溶液中D-松二糖在5.30ppm左右的峰面积与样品溶液中D-松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以系列对照品溶液谱图中D-松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以D-松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，由样品溶液谱图中D-松二糖在5.30ppm左右的峰面积推算样品溶液中D-松二糖含量(mg/g)。

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