CRISPR Cas9基因敲除服务

 

crispr/cas9/grna（crispr-casrna-gudidenuclease）基因敲除技术是继talen基因敲除技术之后又一大突破。与talen和znf技术相比，crispr/cas9系统的载体构建和使用更加方便。基因敲除的特异性由grna而不是蛋白来确定，因此避免了复杂的质粒组装构建过程，甚至使同时敲除多个基因成为可能。不仅如此，实验表明crispr/cas9系统的基因敲除效率与talen、znf的效率相当或者更好。目前cas9的特异性及其它一些特性尚有待进一步研究，但由于其操作极其简便，该技术的应用将大大简化育种，遗传变异修复，及各种基因研究的工作难度。

 

我们现提供cas9/grna基因敲除产品：

cas9/grna基因敲除-质粒转染表达系统cas9/grna基因敲除-慢病毒表达系统cas9稳定表达细胞系

 

cas9/grna基因敲除相关服务：

cas9/grna基因敲除载体构建服务基因敲除细胞系构建服务

 

 

crispr/cas9系统基因敲除原理

crispr (clustered, regularlyinterspaced, short palindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒dna或其他外源dna的免疫机制。在该机制中，cas蛋白（crisp-associatedprotein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条dna链。一旦与crrna（crisprrna）和tracrrna结合形成复合物，cas蛋白中的核酸酶即可对与复合物结合的dna进行切割。切割后dna双链断裂从而使入侵的外源dna降解。
1、cas9蛋白 
来自streptococcus pyogenes的cas9由于pam识别序列仅为2个碱基（gg），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别rna（grna）可以通过载体表达或者化学合成后与cas9蛋白共同进入细胞，对特异dna序列剪切，从而促使dna发生nhej( nonhomologous end-joining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除。
cas9对dna切割示意图： 

2、cas9nicknase蛋白 
cas9nicknase是cas9蛋白的d10a突变体，切割dna单链。由于dna上的nick缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。cas9nicknase需要成对的grna辅助才能实现dna双链断裂。 
采用nicknase蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对grna的设计要求较高。敲除效率也比cas9蛋白低一些。 
简单地说，cas9基因敲除效率更高，操作更容易；cas9nicknase特异性更高。您可以根据实验设计需要进行选择。 
cas9nicknase对dna切割示意图：

我公司crispr/cas9系统产品简介

cas9/grna基因敲除-质粒转染表达系统

包括表达cas9蛋白pcas9/grna1和表达cas9nicknase的pcas9/grna3载体。两个载体都可以同时表达grna。您可以根据靶基因的序列设计靶点，构建针对靶基因的pcas9/grna载体，转染细胞后pcas9/grna载体会对基因靶点进行定点切割，实现基因敲除或重组。

pcas9/grna1和pcas9/grna3载体通过直接转染细胞发挥作用。建议先进行细胞转染实验，转染效率高的细胞株可以采用该系统进行基因敲除。

 

cas9/grna基因敲除-慢病毒表达系统

该系统采用慢病毒表达cas9蛋白，可以构建稳定表达cas9或者cas9nicknase蛋白的细胞系。再在该细胞系的基础上进行基因敲除。适合用于在需要一种细胞系中构建多个基因敲除的实验。由于cas9蛋白稳定表达，该系统的基因敲除效率明显高于质粒转染系统。此外，cas9蛋白稳定表达后，只需导入小分子的grna就能实现基因敲除功能，grna的导入可以根据细胞特性采用质粒转染、人工合成grna转染、aav病毒或者腺病毒导入等多种方式。实验设计更加灵活。

 

crispr/cas9基因敲除实例

pcas9/grna1基因敲除载体对照实验pcas9/grna3基因敲除载体对照实验cas9蛋白稳定表达细胞系293t-cas9对照实验用pcas9/grna1载体敲除293t细胞中的tp53基因