动物源性材料病毒灭活验证 动物源性医疗器械病毒灭活验证DNA残留测试 病毒灭活清除验证

飞凡检测可依据yy/t 0606.25-2014进行动物源性生物材料dna残留量测定法：荧光染色法试验，动物源性生物材料dna残留量测定法：荧光染色法试

yy/t 0606.25-2014标准试验过程解析

飞凡检测试验步骤：

本试验方法所采用的实验方案包括三个步骤:(1)动物源性生物材料的蛋白酶k消化(适用于固体或胶体状材料)，(2)消化后样品的dna纯化(磁珠吸附法)，(3)纯化后样品的dna 残留量测定(荧光染色法)。试验样品除供试品之外，需同步设定回收率试验样品(使用标准品lambda dna)。

材料：试剂和仪器

准备：

试剂：1(蛋白酶k消化用试剂:蛋白酶k(-20?保存，避免反复冻存和融化)，蛋白酶k

缓冲液。2(dna纯化用试剂:磁珠(4?保存)、裂解液、dna结合液、漂洗液、溶出液(室温保存)。3(荧光染色法检测试剂:picogreen染料。

仪器：磁力架，96孔板(黑色)，荧光酶标仪，dnase-free无菌离心管;吸头，冷冻离心机，震荡器，漩涡混悬器，高精度天平(0.00001g)

飞凡检测试验步骤：

注明:以下试验过程中必须采取防止 dnaase 污染的措施，如:戴手套操作、使用没有 dnaase污染的专用实验台和实验用具及仪器。

1.干燥型样品:取供试品(100 ug)，jingque称重并记录，放进1.5 mldnase-free无菌离心管内，用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小，加 depc水至180ul，于冰箱内放置 12,24小时，使样品充分水和、软化。

2.湿润型样品:取供试品(1 cm)，放于1.5 mldnase-free无菌离心管内.13000rpm/min 离心10min，去除液体部分。另取与上述同样大小的样品，分别放于1.5mldnase-free无菌离心管内，13000rpm/min离心10min，去除液体部分后以开盖状态放在安全柜内，令其室温内自然干燥24小时，然后jingque称重并记录，用于样品干重单位重量内dna残留量的计算。

3.胶体型样品:jingque量取供试品 100 ul，放于1.5mldnase-free无菌离心管内，可直接进行下一步实验。

注:胶体型样品:以单位体积的残留 dna 含量表示终结果。

4. 骨质类样品:对于诸如同种异体骨等骨植入物样品应参照ga/t 383-2002中华人民共和国公共安全

注:每份样品设平行样三份，终测定结果取其平均值。

5.将上述供试品剪成尽量小的碎片后，加蛋白酶k缓冲液(10xproteinase kbuffer)20ul，蛋白酶k(20mg/ml)10ul，加depc水至终反应体积为210u l。

注:液态状样品不需要蛋白酶k消化，可直接进行后续的 dna 纯化试验。

6.取dna 标准品(lambda dnastandard)400ng、200ng、100ng、50ng、25ng、ong，用depc水稀释至100ul，分别加在1.5mldnase-free无菌离心管内，添加蛋白消化酶k缓冲液20u l，蛋白酶k(20 mg/ml)10u l，3% bsa80ul(目的是保证与供试品反应系统相同)，至终反应体积为 210ul。

7.依据所选择的方法及使用的试剂盒所附的操作方法进行 dna纯化。

tmtm 举例:使用核酸提取试剂盒(prepse acid extraction

kit)进行dna纯化 ， 在上述各样品中分别加入裂解液 400ul，震荡10秒钟使样

品充分混匀，室温放置10min，使样品完全溶解(多可放置 1-2 小时，直至样品完全溶解)。

8.取出装有磁珠的离心管，以“大速度”震荡 10 秒钟混匀后，取30ul磁珠液分别加入上述各样品内，“低速”震荡 10秒钟混匀。加入 400u l结合液(异丙醇)，震荡5秒钟。室温下震荡(1000 rpm/min)孵育10分钟。再次低速震荡 10秒钟后，将内装样品的离心管放在磁力架上，收集结合有dna 的磁珠，去除上清液。 漂洗dna:加入300ul洗液，低速震荡10秒钟后，将内装样品的离心管放在磁力架上，收集结合有 dna的磁珠，去除上清液。

9.重复步骤:漂洗dna，至少2次。使结合有 dna的磁珠在室温下干燥5分钟。溶出dna:加入50ul溶出液，中速震荡5分钟，于70度水浴槽内孵育5分钟，中速震荡2秒钟后，将内装样品的离心管放在磁力架上，分离dna。

飞凡检测数据分析

本试验方法中回收率试验低样本量为 6.25 ng dna,低于6.25 ng时回收率明显下降，不能满足良好的准确性和精密度。因此，本试验方法中适宜的样本量为?6.25 ng dna/样品。若样品中dna残留量低于 6.25 ng dna/样品时，应加大样品的取样量，同时相应地扩大蛋白酶k消化时的反应体积。

如果在大取样量的条件下仍不能满足上述条件，则只能报告未经回收率校正的检测值作为参考资料，此种情况在终报告中应注明。