青海弧菌Q67法-发光细菌的急性毒性试验 发光细菌生物毒性测定 发光细菌毒性试验

试验原理：

本方法提供的是淡水型发光菌，它无需3％的nacl即可正常生长和发光，故而对于一般水体或污染物的检测有其自身的优点。对一般化学品，可配制恰当浓度的水溶液进行检测。

该淡水发光细菌在干净水体中发光恒定，当受到污染毒物影响时，发光受到抑制，受抑制的程度与水体中毒物的总体浓度相关，故可以用生物与化学发光光度计测定其发光强度，评估该水样的毒性。而毒性大小可按本方法规定的方式表征为参比物苯酚的浓度(mg/l)，或ec50值（能产生抑光率为50％的受测样品的百分浓度。对化学品而言，则为mg/l）。

样品的准备

1．水样的采集与保存

水样采集用预先洗净干燥的500ml广口瓶，一般距水面10-15cm处取样，并装满水瓶，立即用胶带封口。记录水样名称、地点、时间等项目。应在采集后6h内进行毒性测定。如需保存，样品应置于4℃冰箱内，*多不超过12h。结果报告中应说明采集时间和测定时间。从采集到测定不得超过12h。

2．样品处理

(1)水样的预处理

(2)化学品的预处理

(3）固体废物或污泥样品的预处理

3．仪器设备

①生物化学发光光度计：原②微量加液器：③移液管：④容量瓶：⑤旋涡混合器。

⑥摇床。

4．菌种和试剂

(1）菌种

青海弧菌q67(vibtzo）冻干粉剂。封存于安瓿中，每安瓿管0.5g,有效保存期6个月（-18℃或更低）。当按本方法之规定将冻干粉复苏后5min即可恢复发光，在暗室中肉眼应可见其发出的幽幽绿光。经适当稀释后，可用于检测。

(2）试剂

氯化钠（nacl)，化学纯。乳糖，分析纯。

①0.8%氯化钠溶液：氯化钠8g溶于1000mg/l蒸馏水中。保存于4℃，一周内可用。

②10％乳糖溶液：乳糖100g溶于1000ml蒸馏水中，当天配制使用。

(3）参比物

苯酚，分析纯。

①苯酚母液1000mg/l：②苯酚标准溶液20，40,80,100,120,,300mg/l：

试验程序

(1)发光测定的环境条件

室温，18-30℃均可进行，但测试过程中要求温度波动在±1℃内。

(2)测定步骤

1)淡水发光菌冻干粉的菌体复苏：将冻干粉安瓶及复苏液（0.8％的氯化钠）先置于4℃冰箱内约10-15min，然后将该复苏液lml注入安瓶内，置于旋涡混合器上使之充分混匀、溶化，数分钟后在暗室中肉眼应见绿色荧光。若无绿色荧光，则不能使用。将该菌液倾倒于一干净试管内，再以lml复苏液注入安瓶，振荡后再倾入试管内，再次在旋涡混合器上充分振荡混匀。一般每安瓶可加复苏液5-6m1，肉眼检视应为乳白色均匀液体，静置后无沉淀即可应用。

2）样品抑光程度的检测：

3)样品的ec50值的检测：

数据与报告

（1)数据处理

相对发光强度（l）和抑光率（i)的计算：

l(%)＝样品发光强度/对照发光强度×****

i(%)=对照发光强度一样品发光强度/对照发光强度×****

(2)ec50值

ec50是指受试物对发光菌作用后，发光强度下降为对照组的50％时（即相对发光强度为50％或抑光率达到50％时）之受试物浓度。当受试物为水样时，以稀释度（百分浓度）为单位；当受试物为化学品时，以mg/l为单位。ec50值越小，表明受试物的毒性越大。例如对于水样，a样品的ec50=76.5%，表示该样品的稀释度为76.5％时抑光率是50%,b样品的ec50=26.5%，表示b样品的稀释度为26.5％时的抑光率是50%。a样品与b样品相比，显然b样品要比a样品的毒性大，因为达到相同的抑（50%）时，b样品的浓度更低。

对于化学品，假如a样品的ec50=0.lmg/l,b样品的ec50=10mg/l，显然a样品的毒性大于b样品，因为同样抑制发光菌50％的发光，a样品的浓度更小。

样品毒性表达

①用苯酚浓度表示：当未经稀释的样品（即样品稀释度为****）的抑光率在5%-95%时，也即相对发光强度在95%-5％范围内，可以用相同抑光率时苯酚的浓度来表示样品的毒性。大多数水样均在此范围内。

②用ec50值表示：对水样而言，在样品毒性甚大时，即100％浓度的样品其抑光率大于95％乃至使细菌发光完全碎灭时，必须将样品稀释若干倍之后才能进行检测，然后用抑制50％的发光量时该样品的稀释百分浓度来表示样品的毒性。显然稀释百分度越小，毒性越大。一般实测结果不能直接获得ec50值时，可将所测的样品系列浓度（％）与对应的抑光率作图，再通过图上查对50％抑光率所对应的样品百分浓度，即可求得ec50值。

对化学品，ec50值用mg/l的浓度值来表示。显然，ec50值越小，毒性越大。

③毒性表达方式还应注明样品与发光细菌作用的时间，因为作用时间也影响数值大小。如作用15min就与作用20min的数值不同，故还必须表明作用的时间。一般可在数值表达后用括号加注作用时间，例：ec50=0.10%(15min)，或抑光率45%(15min)，表明是作用15min时实测数据。本方法建议采用15min的作用时间。