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体外用gtpγs/gdp处理蛋白以用作阳性和阴性的对照

注意：在细胞体内环境条件下大约有10%的cdc42被激l活，而在体外用gtpγs处理大约有90%的cdc42被激l活。

1. 准备两个离心管，每个管中各加入0.5 ml的细胞提取物（如果是纯的cdc42蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug）。

2. 每个管中加入20ul 0.5m edta(终浓度即为20 mm)。

3. 一个管中加入5ul的100x gtpγs（终浓度即为100 um）作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100xgdp（终浓度即为1 mm）作为阴性对照。

4. 将离心管置于30°c条件下反应30min并不断搅动。

5. 终止反应：将管置于冰上并加入32.5ul 1m mgcl2(终浓度即为60mm)。

1. vasp通过调节rab11依赖性tgf-β受体的质膜靶向来促进肝星状细胞的tgf-β活化

    肝l病学第61卷，首1期，第361-374页，2015年1月

2. rab5活性调节glut4分类为胰岛素反应性和非胰岛素反应性内体室：胰岛素抵抗发展的潜在机制。

    内分l泌学。 2014年9月; 155（9）：3315-28

将裂解液转移到适当大小的试管中，并置于冰上。

如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注射l器针头3-4次以剪切基因组dna。

通过离心10分钟（在4°c下为12，000 x g）清除裂解物。

收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-70°c以便将来使用。

电泳和转膜

1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。

2. 按照制造商的说明进行sds-page。

3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到pvdf或硝化纤l维素膜。

免l疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，active rac，并不断搅拌）

1. 将pvdf膜浸入甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。

2. 封闭：用tbst缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%bsa在室温下孵育1h进行封闭，并需要恒定振荡。

3.孵育一抗：用tbst缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%bsa稀释特异性识别cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°c条件下过夜孵育。

4. 用tbst缓冲液洗涤膜三次/5min。

5.孵育二抗：（例如羊抗兔igg-hrp），用tbst缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%bsa按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。

6. 用tbst缓冲液洗涤膜三次/5min。

7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ecl显色法。

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