怎样用酶去掉植物的细胞壁（二）？

二、酶的选择

1．酶的种类

    构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。

    分离原生质体常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶c；，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。 za3～867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括c1、cx、b一葡萄糖苷酶等），果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。

2．渗透稳定剂

    植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。 因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／l。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；    ②盐溶液系统：包括 kcl、mgso4和 kh2po4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使rna酶不活化，并使离子稳定。

3．酶溶液的ph值

    酶溶液的ph值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始ph值为5．0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当ph值提高到6．0时，初原生质体却产生少，但与ph值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始ph值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。