杂交瘤细胞的筛选方法和原理是什么？杂交瘤细胞生产服务介绍

在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用hat培养进行筛选，hat培养基中含有次黄嘌呤（h）、氨基喋呤（a）和胸腺嘧啶（t）三种成分。细胞的dna合成有内源性途径（主要途径）和外源性途径（旁路途径）两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成dna；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase,hgprt）或胸腺嘧啶激酶（thymidinekinase,tk）的催化下来补救合成dna，hat培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂,能有效地阻断dna合成的内源性途径。

    杂交瘤细胞的筛选

    b淋巴细胞具有hgprttk这两种酶,因此在内源性途径被阻断后仍能利用hat培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成dna，可在hat培养基中存活,但b淋巴细胞是正常细胞,故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和sp2/0-ag14骨髓瘤细胞为hgprt-的tk-缺陷型,缺乏hgprt酶和tk酶在内源性途径被阻断后不能进行dna的外源性合成，故不能在hat培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了b淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成hgprt酶和tk酶，故在hat养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在hat培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。

单克隆抗体与常规的血清抗体不同，血清抗体是针对许多抗原决定簇的抗体的混合体，是由多克隆细胞所产生的。而单克隆抗体是由一个骨髓瘤细胞与一个具有分泌抗体能力的b细胞融合形成的杂交瘤细胞，由这一细胞系分泌的抗体。

     杂交瘤细胞的筛选原理

    细胞的dna合成有主要生物合成途径和补救途径。

    主要生物合成途径就是利用谷氨酰胺（gln）或单磷酸尿苷酸（ump）在二氢叶酸还原酶的催化下合成dna；

    补救途径则利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶脱氧核苷在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hgprt）或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（tk）的催化作用下补救合成dna。

    hat培养基包括次黄嘌呤+氨基喋呤+胸腺嘧啶脱氧核苷，氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效地阻断dna合成的主要合成途径。一般细胞dna的主要生物合成途径被氨基喋呤阻断后，仍然可以通过补救途径进行合成。如果这时候给细胞提供胸腺嘧啶脱氧核苷和次黄嘌呤，在tk和hgprt酶的存在下，dna的合成仍然可以发生，但如果缺少其中一种酶，dna合成就不能发生。

    用于细胞融合的骨髓瘤细胞系是经过药物诱导的代谢缺陷型细胞，所以细胞内缺少tk或hgprt酶。当氨基喋呤存在时，能够阻断dna合成的主要途径，因此要通过补偿途径合成dna，但是因为使用的骨髓瘤细胞和其自身融合物缺乏hgprt酶或者tk酶，在hat培养液中迅速死亡；免疫脾细胞及其融合物虽然有hgprt酶和tk酶，但是一种短命的细胞，在培养液中不能生长繁殖，一般在5～7天内死亡；只有骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合的杂交瘤细胞既获得了骨髓瘤细胞所具有的永生化且繁殖力极强的特征，同时又从免疫脾细胞得到功能性hgprt酶和tk酶的基因产物，因此，这种杂交瘤细胞在hat选择培养液中生长繁殖。

在peg存在下进行细胞融合后，即将细胞悬浮于hat培养液中，分别滴入96孔培养板的小孔中（每孔0.1ml），置5%～7%co2,37℃，饱和湿度的培养箱中培养，约培养2周，融合的细胞繁殖形成集落（克隆），接着，用酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫试验（ria）等敏捷方法检测培养液中有无分泌的特异性抗体，将产生特异性抗体孔的杂交瘤细胞移到24孔培养板中扩大增殖，进行克隆化，再扩大增殖，这样便可建立能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过体外培养或将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内繁殖，即可获得大量的单克隆抗体。

杂交瘤细胞培养及抗体生产服务介绍：

与腹水法制备单克隆抗体技术相比，采用杂交瘤细胞大规模体外培养并纯化抗体的方法，具有抗体纯度高、批间可重复性强、杂质污染少、无动物病毒污染、无动物福利问题等优点。义翘神州提供杂交瘤细胞体外培养制备抗体的服务，可采用低血清或无血清培养基进行高密度体外培养，降低牛igg污染，是国内外客户优选的杂交瘤细胞生产抗体方案。

更多详情尽在：义翘神州网https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service