日本德岛大学研发P–F法DNA合成技术，取消酸化步骤

日本德岛大学研究团队于6月19日在美国化学会《JACS》期刊发表突破性成果：开发出基于5价磷-氟（P(V)–F）单体的DNA化学合成新方法，彻底取消传统霍斯福酰胺法中每轮延伸必经的酸化步骤。该技术已在市售通用DNA/RNA自动合成仪上完成20碱基（20-mer）寡核苷酸的全流程固相合成验证，无需设备改造，为核酸药物规模化生产提供新路径。

当前全球核酸合成产业高度依赖1980年代确立的3价磷霍斯福酰胺法（phosphoramidite method）。该方法虽成熟稳定，但存在根本性工艺缺陷——每添加一个核苷酸，必须执行脱保护、偶联、封端、氧化四步循环。其中氧化步骤使用碘或过氧化物等强氧化剂，不仅延长合成时间、增加副反应风险，还导致大量有机废液产生，推高纯化难度与环保处理成本。尤其在mRNA疫苗、siRNA、反义寡核苷酸等核酸药物量产中，氧化副产物对碱基或磷酸骨架的非特异性修饰，已成为影响终产品纯度与临床安全性的关键瓶颈。

德岛大学团队的解决方案直指70年未解难题：绕过3价磷中间体，直接以预氧化的5价磷结构构建核酸链。其核心是设计并制备出四种标准核苷（dA、dC、dG、dT）对应的3′-磷酰氟（nucleoside 3′-phosphorofluoridate, P(V)–F）单体。这类单体因P–F键极强（键能约490 kJ/mol），在空气和湿气中高度稳定，可常温储存、常规运输，无需超干燥溶剂或惰性气体保护，大幅降低试剂储存与操作门槛。团队已完成全部四种P(V)–F单体的克级纯化与表征，建立可放大的合成路线。

P(V)–F单体的活性调控机制

高稳定性必然伴随低反应性——这曾是1950年代托德（Todd）等人尝试5价磷路线失败的主因。德岛团队的关键突破在于引入硅基活化剂（silicon-based activators）。利用硅与氟之间极强的亲和力（Si–F键能高达565 kJ/mol），活化剂选择性攫取P(V)–F单体上的氟原子，瞬间生成高活性磷正离子中间体，触发快速亲核取代反应。该过程实现“按需激活”：单体在储存与输送阶段保持惰性，仅在偶联瞬间爆发反应活性。模型反应显示，在优化硅试剂与碱基配比下，二核苷酸偶联收率接近，且偶联速率不低于甚至优于传统霍斯福酰胺法。

这一机制使P(V)–F法摆脱了“5价磷=反应慢”的历史桎梏。更重要的是，它规避了3价磷体系中因水分/氧气引发的试药失活问题——后者迫使工厂持续通入氩气、使用分子筛级溶剂，设备维护与耗材成本居高不下。而P(V)–F单体对环境宽容度的提升，意味着中小规模CDMO企业或高校平台可降低合成设施门槛，减少对高规格洁净环境与特种气体系统的依赖。

自动合成仪兼容性验证与工艺简化价值

团队将P(V)–F体系直接适配至商用固相DNA合成仪（如GE Healthcare、BioAutomation等主流型号），未做任何硬件改装。通过系统优化试剂浓度、溶剂配比（采用更温和的乙腈/体系）、硅活化剂注入时序及固相载体反应时间，成功获得20碱基长度的寡核苷酸，HPLC纯度与质谱确认结构完整。这意味着现有产线只需更换试剂盒与调整程序参数，即可导入新技术。

取消氧化步骤带来的工艺重构价值显著：单轮循环从4步压缩为3步（脱保护→偶联→封端），合成总时间缩短15%–25%；氧化试剂（如碘溶液）及其配套清洗液用量归零，有机废液总量下降约30%；副反应源减少后，粗产物中缺失序列（n−1）、加合物等杂质比例降低，后续HPLC或PAGE纯化负荷减轻，树脂载量利用率提高。对国内核酸CDMO厂商而言，该技术可缓解当前mRNA原料药生产中普遍存在的“氧化损伤导致批次纯度波动”问题，尤其利好需高纯度长链（≥50mer）的ASO与saRNA项目。

对国内核酸产业链的实际影响

日本在核酸合成试剂领域长期处于上游主导地位，东京化成（Tokyo Chemical Industry）、三菱化学（Mitsubishi Chemical）等企业供应全球超60%的霍斯福酰胺单体。P(V)–F单体虽处实验室阶段，但其合成路径明确（以核苷为起始，经氯代、氟代两步）、原料易得（氟化钾、等均为国产大宗化工品），具备本土化放量基础。国内已有数家精细化工企业具备核苷膦酸酯类中间体合成能力，若跟进P(V)–F单体开发，有望打破高端核酸试剂长期依赖进口的局面。

对采购与生产端，需重点关注三点：一是P(V)–F单体对硅活化剂的专一匹配性，不同供应商的活化剂配方将直接影响偶联效率与重复性，建议要求提供配套试剂包而非单独采购单体；二是现有合成仪的程序重编译支持度，部分老旧机型可能需厂商提供固件升级；三是下游纯化策略调整——因氧化副产物消失，传统针对碘残留的脱盐柱或额外洗涤步骤可精简，但需重新验证新工艺下的杂质谱，避免因封端不完全导致的短链杂质上升。德岛大学已与日本两家核酸CDMO企业启动中试合作，预计2–3年内形成公斤级P(V)–F单体供应能力，中国客户可优先关注其技术授权或联合开发动向。