pCas9/gRNA1载体基因敲除对照实验

 

实验原理

ptyne载体在egfp编码框上游有2个错码的atg起始密码子，由于不能有效地启动egfp表达，ptyne转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据ptyne载体的序列设计了pcas9/grna1对照阳性质粒pcas9-p，该质粒上的grna与ptyne上egfp编码区上游结合。pcas9-p表达的cas9蛋白和grna组合现对ptyne载体切割，经细胞修复后，突变的ptyne将表达出读码框正确的egfp蛋白，发出明亮的绿色荧光。

pcas9/grna1阳性对照载体（pcas9-p）靶序列：cttcgaattctgcagtcga。该靶点位于ptyne egfp基因上游。

pcas9/grna1阴性对照载体（pcas9-n）靶序列：atcgactagccactcagac。该序列为随机序列。

 

pcas9-p靶点在ptyne载体上的位置:

 

cas9切割原理:

 

实验内容

1、实验材料

ptyne质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：cr1011）
pcas9 –n质粒（pcas9/grna1阴性对照，货号：cr1003，无内毒素试剂盒制备）
pcas9 –p质粒（pcas9/grna1阳性对照，货号：cr1002，无内毒素试剂盒制备）
polyfect-v转染试剂（货号：p2010-1）
293t细胞系

 

2、实验步骤

1)转染前24小时将293t铺到24孔板中。同时准备2个孔。

2)按照下列体系制备2个质粒稀释液

组a

组b

ptyne 0.4ug

ptyne 0.4ug

pcas9 –n 0.4ug

pcas9 –p 0.4ug

dmem培养基x ul

dmem培养基 x ul

总体积50ul

总体积50ul

3)准备转染试剂稀释液：

polyfect-v转染试剂 3.2ul

dmem培养基 96.8ul

4)将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。

5)将转染液加入293t细胞。

6)48小时后检测egfp荧光表达。

 

3、实验结果