北海群林生物枯草芽孢杆菌培养基的配制方法

枯草芽孢杆菌常用培养基配方：

    1l蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂

    枯草芽孢杆菌原生质体的制备 

    1 培养枯草芽孢杆菌 
取亲本菌株t4412、tt2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(cm)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 ml 菌液转接入装有20 ml 液体完全培养基的250 ml 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/ml 青霉素，使其终浓度为0.3 u/ml，继续振荡培养2 h。 

    2. 收集细胞 
各取菌液10 ml，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 ml smm 中，每ml 约含108～109 活菌为宜。 

    3. 总菌数测定 
各取菌液0.5 ml，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1ml(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 

    4. 脱壁 
    二株亲本菌株各取5 ml 菌悬液，加入5 ml 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/ml，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 ml 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 

    5. 剩余菌数测定 
    取0.5 ml 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 ml，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 
    计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。